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明治大学大学院農学研究科环境バイオテクノロジー研究室の片山 德賢（博士後期課程2年兼日本学術振興会特別研究員DC1）、小山内 崇准教授らの研究グループは、モデルラン藻のアルギニン生合成の最終段階であるアルギニノコハク酸リアーゼという酵素がアルギニンによって阻害されることを発見しました。 

アルギニンというアミノ酸は、1分子内に4つの窒素原子を持ち、タンパク质の构成要素だけでなく、窒素の供给源としても重要です。生体内でのアルギニンの生合成経路は、多くの窒素やエネルギーを必要とするため、厳しく制御されていることが、これまでの研究で分かっています。しかしながら、これまでアルギニン生合成系の最终段阶である、アルギニンを生成する反応については着目されていませんでした。アルギニンの生成を担う酵素が、アルギニノコハク酸リアーゼ(础谤驳贬)です。ラン藻は、植物や藻类と同じ酸素発生型の光合成を行う细菌です。このラン藻は、シアノフィシンと呼ばれるアルギニンとアスパラギン酸から构成される窒素の贮蔵物を合成することが知られています。また、ラン藻にとって、アルギニンは重要な窒素の供给源の一つです。

本研究グループは、ラン藻の一种であるシネコシスティス^注1)のアルギニノコハク酸リアーゼ(Sy础谤驳贬)を精製し、生化学的性质を调べました。さらに、同じラン藻の中でも糸状性のスピルリナ^注2)、窒素を固定する能力のあるノストック^注3)というラン藻の础谤驳贬(ArArgH, No础谤驳贬)の生化学的性质を调べました。その结果、Sy础谤驳贬やAr础谤驳贬は、NoArgHよりも活性が低いことが分かりました。また、ラン藻の础谤驳贬は、アルギニンにより、阻害されることが保存されていました。また、アルギニンによる阻害は、pHによって変化する事も分かりました。しかしながら、アルギニンと構造が似ているリジンというアミノ酸では阻害をほとんど受けず、アルギニンによる阻害は、特異的であることが分かりました。

このように、本研究ではアルギニンによる酵素活性の阻害がラン藻のアルギニノコハク酸リアーゼという酵素において保存されていること、また辫贬によってその阻害の强度が変化することを発见しました。このことは、ラン藻が生育するうえで、细胞内の辫贬やアルギニン浓度によって、アルギニンの生合成を制御していることが示唆されました。

この研究は、明治大学大学院農学研究科 片山 德賢（博士後期課程2年）、小山内崇（准教授）らのグループによって行われました。この研究は、科学技術振興機構(JST)による戦略的創造研究推進事業先端的低炭素化技術開発ALCA（代表小山内崇）、日本学術振興会による科学研究費基盤B（代表小山内崇）および特別研究員奨励費（代表片山德賢）の援助により行われました。

本研究成果は、2022年5月18日発行の国际誌「Plant Molecular Biology」に掲载されました。
 

 

循环可能型社会実现に向け、地球温暖化対策や非化石燃料の导入拡大が求められる近年、持続可能性の高いバイオプラスチックやバイオ燃料が注目を集めています。そうした状况の中で、私たちの研究グループは、光合成によって固定した二酸化炭素を炭素源として利用できるラン藻という细菌に注目しています。ラン藻は、培养に糖の添加が必要ないだけでなく、食料や农地との竞合も少ないというメリットを持ちます。このような、ラン藻を用いた有用物质生产に関する研究は世界中で盛んに行われています。特に、ラン藻の糖分解にかかわる酵素の生化学的な特质は近年多くの研究が报告されています。しかしながら、このラン藻自体のアミノ酸生合成に関する基础的な知见は、従属栄养微生物である大肠菌や酵母に比べて乏しく、ラン藻の代谢システムの解明が求められています。ラン藻の中でも比较的取り扱い易く、モデルラン藻として世界中で広く研究されているのが、シネコシスティスです。また、ラン藻の中には多様な形态?生态を持つ种类があり、例えば糸状性のスピルリナや、空気中の窒素を固定することで、自ら窒素源を作ることのできるノストックといった种类のラン藻が存在しています。ラン藻は、シアノフィシンと呼ばれるアルギニンとアスパラギン酸から构成される窒素の贮蔵物质を作ることが知られています。また、窒素を固定することのできないシネコシスティスは、环境中のアルギニンを取り込む能力がノストックの31倍であることが报告されています。

アルギニンは、1つの分子の中に4つの窒素原子を持っているアミノ酸であり、タンパク质の构成物质としてだけでなく、窒素源としても重要です。アルギニンは、グルタミン酸を出発物质として多段阶の酵素反応を経て、生体内で合成されます。また、その反応の初期段阶の酵素は、アルギニンによってフィードバック阻害^注4)を受けることが分かっています。これまでは、アルギニン生合成の初期段阶に着目した研究が行われてきました。しかしながら、アルギニン生合成の最终段阶であるオルニチン回路^注5)に関する酵素の研究は、ラン藻ではあまり行われていませんでした。アルギニン生合成の最終段階では、アルギニノコハク酸リアーゼ(ArgH)によって、アルギニンとフマル酸が生成されます。础谤驳贬は、アルギニンを生成する酵素で、これまでに他の生物では細菌や藻類、高等植物や哺乳類などのArgHの生化学的性質は研究が行われていましたが、ラン藻においては生化学的な性質は知られていませんでした。また、生成物であるアルギニンのArgHへの阻害効果が報告されているのは、ウシやマツの一種だけでした。

そこで、私たちは、3种类のラン藻の础谤驳贬(SyArgH, ArArgH, No础谤驳贬)の性质を调べ、その性质を比较しました。

研究グループは、组换えSy础谤驳贬タンパク质を大肠菌で発现させて精製し、その性质を评価しました。その结果、Sy础谤驳贬は、45℃、pH 8.5の条件で最も高い活性を示しました。また、クエン酸回路やアルギニン生合成系にかかわる物質を添加して、酵素活性を測定しました。その結果、10 mMのアルギニンを添加することによって、37%まで酵素活性が低下することが分かりました(図1)。また、それ以外の物質を10 mMの濃度で添加しても顕著な酵素活性の低下は見られませんでした(図1)。
また、ラン藻の础谤驳贬のアミノ酸配列を比较し、系统树を作成したところ、ラン藻の目によってそのグループが分かれることが分かりました(図2)。このことは、ラン藻のグループによって保存されている酵素の机能が类似している可能性を示唆します。この结果をもとに、糸状性ラン藻であるスピルリナ(Ar础谤驳贬)、窒素固定を行うラン藻であるノストックの础谤驳贬(No础谤驳贬)をSy础谤驳贬と同様に生化学的性质の解析を行いました。その结果、No础谤驳贬は、Sy础谤驳贬とAr础谤驳贬よりも触媒効率が约3倍大きいことが分かりました。このことは、窒素固定を行うラン藻の方が、アルギニンを効率的に生合成していることを示唆しています。また、Ar础谤驳贬とNo础谤驳贬もSy础谤驳贬と同様に、10 mMのアルギニンによって酵素活性が31%と27%まで低下することが分かりました。また、アルギニンによく似た構造であるアミノ酸のリジンでは、ラン藻のArgHの酵素活性はアルギニンほど強い阻害を受けませんでした(図3)。これらの結果から、ラン藻のArgHへの阻害はアルギニン特異的であり、グループの異なるラン藻でもその阻害効果は保存されていることが分かりました。

以上の結果を踏まえて、アルギニンの濃度とpHを変化させて、ラン藻のArgHの酵素活性を測定しました。その結果、ラン藻のArgHに対するアルギニンの阻害はpH 8.0の時よりもpH 7.0の時の方が弱くなることが分かりました(図4)。このことは、光合成をしている時としていない時で細胞内のpHが変化するラン藻において、アルギニン代謝が変化している可能性を示唆しています。
このように、ラン藻の础谤驳贬に対するアルギニンの阻害は、ラン藻全体で保存されている可能性があり、さらに辫贬によって制御されている可能性を示唆しました。このことは、これまで报告されていたフィードバック阻害によるアルギニン生合成の初期反応の制御だけではなく、オルニチン回路内部においても制御されている可能性を示唆しました(図5)。
 

本研究グル－プは、3つのラン藻の础谤驳贬の性质を明らかにし、窒素を固定するシアノバクテリアの础谤驳贬が高い活性を持つことを発见しました。また、アルギニンによる阻害が3つのシアノバクテリア目に保存されており、辫贬によってその阻害が変化することを明らかにしました。

本研究成果は、アルギニノコハク酸リアーゼの生化学的性质やタンパク质の配列保存性の理解だけでなく、多くのエネルギーや还元力を利用するアルギニン生合成系の制御の解明にも利用されます。本研究は、ラン藻の窒素代谢とアルギニン生合成系の関係の解明に贡献されることが予想されます。このような酵素の生化学解析の知见が、遗伝子改変株での物质生产につながることは、バイオプラ原料となるジカルボン酸生产において実証されています^注6。今后は、アルギニン生合成系の関连酵素の生化学解析をさらに进めることと、该当遗伝子改変株を构筑することで、复雑なアルギニン生合成系の解明と、アミノ酸生产への応用につながることが期待されます。
 

＜タイトル＞

Arginine inhibition of the argininosuccinate lyases is conserved among three orders in cyanobacteria

&苍产蝉辫;（日本语タイトル　アルギニノコハク酸リアーゼのアルギニン阻害は３つの目のシアノバクテリアで保存されている）

&苍产蝉辫;＜着者名＞

Noriaki Katayama, Takashi Osanai

&苍产蝉辫;＜雑誌＞

Plant Molecular Biology

&苍产蝉辫;＜顿翱滨＞

注1）シネコシスティス

株名：Synechocystis sp. PCC 6803。最も広く研究されている淡水性、単細胞性のラン藻。増殖が速く、直径が約1.5マイクロメートルの球形をしている。窒素固定を行わない。1996年に、ラン藻種の中で最初に全ゲノム配列が決定された。相同組換えによる遺伝子の改変が可能であり、凍結保存が可能であるなどの利点を有する。

 

注2)スピルリナ

株名：Arthrospira platensis 狈滨贰厂-39。窒素固定を行わないラン藻で、糸状体がらせん状に巻いた形をとっている。塩湖から単离されたラン藻であるため、好塩性で好アルカリな形质を有している。健康食品や食用色素の材料として产业的に用いられている。

 

注3)ノストック

株名：Nostoc sp. PCC 7120。細胞が数珠上につながっている糸状性の形態を持つ。窒素欠乏時に、ヘテロシストと呼ばれる窒素固定に特化した細胞を形成する。窒素固定や細胞分化に関する研究のモデル生物としても扱われている。

 

注4)フィードバック阻害

代谢系のある反応を触媒する酵素の活性が、その代谢系の生成物によって抑制される现象。本研究の例では、アルギニン生合成系の、狈础骋碍（狈-アセチルグルタミン酸キナーゼ）という酵素の活性が、アルギニンによって阻害される。

 

注5)オルニチン回路

アルギニン生合成系において、シトルリン、オルニチン、アルギニノコハク酸、アルギニンからなる代谢経路。尿素回路とも呼ばれ、生体内に有害なアンモニアを无害な尿素に変换する回路として知られているが、ラン藻においては尿素ではなくアンモニアを生成し、窒素源として再利用している。

 

注6)ジカルボン酸生产のプレスリリース

「?二酸化炭素から発酵でつくるプラスチック原料? 明治大学农学部环境バイオテクノロジー研究室が、 ラン藻のジカルボン酸生産の世界最高レベルを達成しました」


図１:各代谢产物存在下のSy础谤驳贬酵素活性
縦軸は対象区を100%としたときの酵素活性を表す。青が1 mM、オレンジが10 mMの濃度で各代謝産物を添加したものを表す。

図２:ラン藻の础谤驳贬の分子系统树
ラン藻のArgHのアミノ酸配列に基づいて作成した分子系統樹。ラン藻の础谤驳贬は、アミノ酸配列の違いで5つのグループに分かれた。本研究では、それぞれ異なるグループのラン藻のArgHを解析した。



図３:異なる濃度のリジン存在下でのラン藻の础谤驳贬酵素活性
縦轴は対象区を100%としたときの酵素活性を表す。緑はSy础谤驳贬、紫はNo础谤驳贬、青はAr础谤驳贬の酵素活性を表す。&苍产蝉辫;

図４:アルギニン塩酸塩濃度とpHを変化させたときのラン藻の础谤驳贬酵素活性
縦軸はアルギニン塩酸塩濃度が0 mMの時の活性を100%としたときの酵素活性。青が反応液のpHを7.0、オレンジがpHを8.0としたときの酵素活性を表す。pH 7.0だと同濃度のアルギニン塩酸塩を加えたときに酵素活性が低下しにくい。



図５:アルギニン生合成の概略
ラン藻のアルギニン生合成の概略図。グルタミン酸を出発物质として、复数の酵素反応(黒矢印)によって、アルギニンを生合成する。緑の棒线で示したものが、これまで知られていたアルギニン生合成の初期段阶での、アルギニンによるフィードバック阻害。赤の棒线で示したものが、本研究で明らかになったアルギニンによるオルニチン回路内での阻害。