明治大学大学院農学研究科環境バイオテクノロジー研究室の村上 雅（博士前期課程２年?発表当時）、小山内 崇准教授らの研究グループは、好熱性の微細紅藻類シアニディオシゾン（通称シゾン）
の生化学的な特徴を明らかにするとともに、酵素を固定化することで、酵素の安定性を向上させました。真核红藻のβ-アミラーゼが、これまでの他の生物由来のβ-アミラーゼと比较してアミロース
β-アミラーゼは、デンプンなどの多糖類を加水分解してマルトース（麦芽糖）を生成します。β-アミラーゼは、食品や医薬品の製造などの幅広い産業で利用されています。真核の紅藻であるシゾンは、最適pH 2.0-3.0、最適温度40-50 ℃で生育する単細胞の藻類です。また、シゾンは培養時の微生物汚染リスクが低く、細胞からのタンパク質の抽出を簡便に行うことが可能です。さらに細胞構造がシンプルで、遺伝子改変も可能です。これらのメリットから物質生産に適した性質を持つことが期待されています。本研究グループではシゾンのタンパク質の耐熱性、耐酸性に着目し、シゾン由来のβ-アミラーゼ（以下、CmBAM）の特性を調べ、シゾンを利用した物質生産において重要な糖代謝経路におけるCmBAMの関係性を考察するとともに、CmBAMの工業用酵素としての利用可能性の検討を行いました。実験の結果、CmBAMは47℃、pH 6.0において最も高い活性を示しました。CmBAMはデンプンを基質とした場合と比較して、アミロース対して高い特異性を示しました。さらにCmBAMをシリカゲル担体に固定化することで、保存安定性と耐熱性が向上し、酵素の再利用が可能になりました。CmBAMの至適温度とpHは、既存の大麦や小麦由来のβ-アミラーゼと同程度でした。報告されているいくつかのβ-アミラーゼの中でも、CmBAMはデンプンよりもアミロースに高い特異性を持つユニークなものであることがわかりました。シゾンはアミロースを利用しないにも関わらず、予想に反してCmBAMがアミロースに対し高い特異性を示したことは、デンプンのα-1,6结合
（注4）を切断する酵素が生体内で协働している可能性を示唆するものです。また、植物由来のβ-アミラーゼを固定化したいくつかの报告と比较すると、固定化颁尘叠础惭は、再利用性は最も高く、30日保存时の保存安定性は3番目でした。また、固定化颁尘叠础惭は15～20℃、耐热性が向上していることから、応用范囲が広がり、取り扱いが容易になることが期待されます。
本研究は、明治大学大学院農学研究科 村上雅（博士前期課程２年?発表当時）、小山内崇准教授らのグループによって行われました。また、本研究は、科学技術振興機構(JST)戦略的創造研究推進事業先端的低炭素化技術開発ALCA、日本学術振興会科学研究費基盤B及び、同挑戦的研究（萌芽）（以上、代表小山内崇）の援助により行われました。
本研究成果は、2022年10月4日発行の米国化学会の国际誌「
ACS Omega」に掲载されました。
※研究グループ
明治大学大学院农学研究科 环境バイオテクノロジー研究室
准教授 小山内 崇（おさない たかし）
博士前期課程２年（発表当時） 村上 雅（むらかみ みやび）
１．背景
近年、化石资源への依存や、それに伴う地球温暖化が问题视されており、循环型社会の実现に向け、バイオマス资源に注目が集まっています。そうした状况のなかで、私たちの研究グループは、光合成によって空気中の二酸化炭素を唯一の炭素源として利用できる微细藻类に着目し研究を行っています。微细藻类は、培养に糖などの炭素源を必要とせず、食料や农地との竞合も少ないというメリットを持ちます。微细藻类の中でも本研究で扱っているシゾンは酸性の温泉などに生育する好热性の単细胞红藻であり、その特殊な生育条件から、培养时の微生物汚染リスクが少なく、一部のタンパク质は耐热性を持つことが明らかとなっています。以上の理由からシゾンの持つ酵素などのタンパク质も耐热性を持つことが予想され、产业用酵素としての利用の可能性も期待されます。また、シゾンは全ゲノム配列が明らかとなっており、遗伝子改変も可能なことから、モデル生物として様々な研究が行われてきました。シゾンは生体内で红藻デンプンを合成し、细胞内に颗粒状で贮蔵しており、このデンプン资源を利用した油脂生产に関する研究报告もあります。しかしながら、シゾン由来の酵素の产业利用や、シゾンの糖代谢における酵素の特性解析はほとんど行われておらず、物质生产に重要な糖代谢やそれに関连する酵素の详细な理解は不十分でした。そこで本研究では、シゾンが持つβ-アミラーゼに着目し、その性质を明らかにすることで、糖代谢への理解を深めるとともに、シゾン由来の酵素の产业利用の可能性を考察しました。
β-アミラーゼはデンプンなどの糖类のα?-1,4结合を加水分解し、マルトースを生成する酵素です（図1）。幅広い产业に利用されており、生成物であるマルトースは、水飴や输液としても用いられています（図1）。现在、产业においては主に穀类由来のβ-アミラーゼが使用されています。しかし、穀类需要の増加などに伴い、供给の不安定性が悬念されており、代替となるβ-アミラーゼの探索、研究が进められています。
また、酵素は温和な条件での反応や高い触媒活性、基质选択性など、触媒として多くのメリットを持っています。しかし、产业において利用する场合には、热や辫贬に対する安定性が低く、金属イオンやその他の化学物质などによる反応阻害などの课题があります。酵素を担体に固定化することは、安定性を向上させ、上述した课题を解决するだけでなく、回収、再利用を可能にすることで、利用の幅を広げ、コストダウンにもつながることが期待されます。そこで本研究グループは、シゾンの酵素の产业利用を目的として酵素の安定性向上につながる酵素の固定化试験を行いました。
２．研究手法と成果
本研究グループは、组换え颁尘叠础惭タンパク质を大肠菌で発现させて精製し、その性质を评価しました。その后、酵素の产业利用の可能性を考虑し、酵素の固定化を行いました。
その結果、CmBAMは、47℃、pH 6.0の条件で最も高い活性を示しました。CmBAMを50℃で処理した後に59.8%の活性が残存していました（図2）。また、デンプン以外の多糖を基質とした場合、これまで報告された他の生物由来のβ-アミラーゼと比較してアミロースへの高い特異性を示すユニークな酵素であることが明らかになりました。これらの結果を受け、細菌由来の酵素や植物由来の酵素との比較を行うため、他の生物が持つβ-アミラーゼのアミノ酸配列を比較し、系統樹を作成し、比較を行いました。その結果、細菌型と植物型で大きく分かれ、紅藻や緑藻などの藻類や植物が持つ糖代謝関連酵素群が共通の真核生物に由来するものであるという知見と一致する結果となりました。さらに、典型的なβ-アミラーゼ阻害剤として知られているいくつかの金属イオンや、糖類などを添加して活性測定を行ったところ、他のβ-アミラーゼと比較して金属イオンへの感受性が低いことがわかりました（図3）。
また、固定化により耐热性が15?20℃向上しました（図2）。さらに、冷蔵条件での安定性も向上し、10回の再利用が可能になりました（図4）。
以上の结果から、これまでの产业利用されている植物型酵素と比较しても、いくつかの点において同等の性质を持ち、固定化により、酵素をより安定な形で利用できるようになることが明らかになりました。この结果は、颁尘叠础惭及びその固定化酵素の产业利用への可能性を示唆する结果となりました。
３．今后の期待
本研究グル－プは、好热性微细藻类のβ-アミラーゼの特性を明らかにし、酵素の固定化によりその耐热性、安定性を向上させました。
本研究の成果は、シアニディオシゾンのβ-アミラーゼの详细な解析により、糖代谢のさらなる理解の进展に寄与するものです。さらに、微细藻类由来の酵素の产业利用の可能性の新たな知见を提供することで、微细藻类を利用した有用物质の生产の実用化に贡献することが予想されます。今后は、デンプン合成系の関连酵素の生化学解析をさらに进めることや、该当遗伝子改変株を构筑することで、より详细な糖代谢の解明と、物质生产への応用につながることが期待されます。
４．论文情报
＜タイトル＞
Biochemical properties of β-amylase from red algae with concerning starch metabolism and improvement of its thermostability through immobilization
（日本语タイトル）
淀粉代谢に関わる红藻由来β-アミラーゼの生化学的性质の解析と固定化による耐热性の向上
＜着者名＞
Miyabi Murakami, Takashi Osanai
＜雑誌＞
ACS Omega
＜顿翱滨＞
５．补足説明
株名：Cyanidioschyzon merolae NIES- 3377。硫酸酸性の温泉に生育する、単細胞の真核紅藻。増殖が速く、直径が約1.5 μmの楕円形をしている。真核藻類の中で最初に全ゲノム配列が決定された。真核生物としては細胞の構造が単純で、遺伝子の改変が可能であることから、モデル生物として様々な研究が行われている。
デンプンなどの多糖を分解する酵素アミラーゼの中でも、糖锁のα-1,4结合を加水分解し、マルトース（麦芽糖）を生成する酵素。食品や医薬品など様々な利用用途があり、产业上重要な酵素である。
デンプンの一成分で、アミロペクチンとともにデンプンのクラスターを构成する。高等植物に存在し、デンプンの20～30％を占める。
α-グルコースの1位と6位の炭素に结合するヒドロキシ基が缩合してできる结合。
図1 β-アミラーゼによるデンプン分解の模式図と水飴…デンプンの末端からα-1,4結合を連続でマルトース（麦芽糖）単位で分解する。 水飴の主成分はマルトースである。
図2 可溶化（遊離）したCmBAMと固定化 CmBAM の加熱処理後の相対活性…各温度で30分間インキュベートした後の残存活性を示した。可溶化した通常のCmBAMの活性を黄色の丸で、固定化したCmBAMの活性を赤色の菱形で示した。
図3 各種金属イオン及び適合溶質を添加したときのCmBAMの相対活性…縦軸は何も加えていない時のCmBAMの活性を100％とした時の相対活性を表す。黄色はコントロール、水色が1 mM青が10 mM、灰色が0.5 mMの濃度で各物質を添加したときの酵素活性を示す。
図4 固定化した颁尘叠础惭の再使用后の残存活性…10回の回収、反応を繰り返し行い、反応1回目の活性を100％とした时の各回における相対活性を示す。